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DNA的G+C含量測定



錄入時間:2020-5-19 10:39:55 來源:青島海博生物

(一)熔解溫度(Tm)法

 

1.菌株培養和收集

 

  (1)固體平板法:以菌懸液接種千平皿或克氏瓶的瓊脂培養基上,培養基和培養條件選其菌最合適的。一般24h(生長慢的菌可延長;芽孢菌應縮短,控制在生孢之前)后,用0.15 mol/LNaCl與0.1 mol/LEDTA (pH8.0)緩沖液洗平板,收集菌體。

  (2)液體搖瓶法:接種斜面種子于裝有液體培養基的三角瓶內,置200 r/min的搖床培養16-24h后離心。以上述同樣的緩沖液洗細胞,最終溶于同樣的緩沖液中,濃度為2~3g濕細胞125 ml緩沖液。

 

2.DNA提取和純化

 

  (1)將上述培養液或細胞懸液離心收集細胞,并以TE緩沖液(10mmol/LTris­HCI;1m mol/LEDTA, pH8.0)洗細胞,懸浮于50m mol/LTris-HCI—5 m mol/L EDTA (pH 8.0)緩沖液中。

  (2)加溶菌酶0.5-1 mg/ml(終濃度),置37℃水浴搖床30-60 min。

  (3)加SDS(20%)至終濃度2%, 60℃水浴10 min或更長。

  (4)加5 mol/LNaCI04至終濃度為1 mol/L。

  (5)加等體積氯仿-異戊醇(24:1 v/v),振蕩10 min。

  (6)離心5000 r /min, 10 min。

  (7)吸取含DNA的上清水層,加2倍體積乙醇(95%)。

  (8)用玻璃棒卷出DNA絲。

  (9)溶于0.1 SSC (0.1 SSC: 0.015 mol/LNaCl-0.0015 mol/L檸檬酸鈉)。

  (10)重復5~9步驟2~3次,視樣品含蛋白質量而定。

  (11)加終濃度為50 µg/ml的RNA酶,(RNA酶在0.15 mol/LNaCl (pH 5.0)中80攝氏度預處理10 min,以除DNA酶)置37℃水浴搖床30 min。

  (12)加等體積氯仿-異戊醇搖10 min。

  (13)離心5000 r/min, 5 min。

  (14)吸取水相,加2倍體積乙醇(95%)。

  (15)用玻璃棒卷出DNA絲。

  (16)重復12-15直至無蛋白層。

  (17)加1 ml 3mol/LNaAC-0.001 mol/L EDTA pH 7.0。

  (18)邊攪邊加0.54倍體積的異丙醇。

  (19)溶于O.lSSC。DNA純度檢查:O.D值230:260:280=0.454中0.515

 

3.Tm測定

 

  (1)儀器:帶加溫裝置的紫外分光光度計。

  (2)步驟:①心波長固定于260 nm;②將待測樣品用O.lSSC稀釋至OD260值于0.3~0.6間;③在波長260 nm首先記錄25℃飛的吸光度(A25 )然后溫度迅速上升至50℃;④每隔3~5℃記錄一次;⑤OD值開始上升表示變性開始,每隔l℃穩定5 min,記錄杯內溫度和OD值,直至OD值不變表示變性完畢。

 

4.Tm值計算

 

  (1)熱變性溫度測定完成后,將記錄的溫度和相應光密度整理成表。

  (2)含各光密度乘相應溫度的相對膨脹系數(Vt)與25℃時光密度相比Vt/V25,求得相對的光密度。

  (3)以溫度為橫坐標,以相對光密度為縱坐標,繪制熱變性曲線。熱變性曲線中點相對應的溫度即為熔鏈溫度(Tm值)。

 

5.G+C mol%含量計算

 

  0.1SSC:G+Cmol% =2.44Tm-69.3

  1SSC:G+Cmol% =2.08Tm-106.4

  注:必須以大腸埃希氏菌(E.coli K12)為參比操作對照,以核實實驗誤差。

 

 

(二)浮力密度法

 

  在氯化銫(CsCI)中DNA的浮力密度(ρ)與它的G+C含量呈線性增長關系。當DNA分子在CsCl溶液中高速離心時,會在CsCl密度梯度形成的一定部位形成DNA帶。這個帶的DNA分子密度相當于這個部位的CsCl的密度,這個帶中點的DNA密度稱作為它的浮力密度(ρ)。

  稱固體CsCl 6.3 g溶于合適的緩沖液(0.05mol/LTris-HCl pH 7.3)調整到最終重置為10g,即密度約1.700 g/cm 3,分別使1 ml C-sCl緩沖液含2-3 µgDNA和相同量 的標準DNA,重新調密度到1.700 g/cm 3,并用折射儀作簡單核算:1.700密度相當于折光指數1.3994。將溶液倒入10mm的單個分段杯放入離心機轉頭, 然后于分析超速離心機中逐漸加速至45,000 r/min, 25℃離心20h。利用DNA對紫外吸收來確定未知DNA密度帶的位置和標準DNA密度帶的位置,求得它們與離心機中心的距離(r和r0)。

  利用公式:

  ρ= ρo + 0. 0092 (r2-r20),ρ0為標準DNA密度(E.coli的ρo為1.710 g/cm3 )。根據Schildkraut公式, 求出待測DNA的G+C含量:

  ρ= 1.66 + 0.098 (G+ C)

  本文節選自《常見細菌系統鑒定手冊》第十五章。

 

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